Spectrophotométrie UV-Visible : Appareillage, Principes et Applications en Pharmacie

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Introduction : Pourquoi la Spectrophotométrie UV-Visible est Incontournable en Pharmacie ?

La spectrophotométrie UV-Visible est l’une des techniques analytiques les plus utilisées dans les laboratoires pharmaceutiques, hospitaliers et de recherche.

Simple, rapide, précise et non destructive, elle permet d’identifier des substances, de contrôler leur pureté et de les doser avec une fiabilité remarquable.

Basée sur l’interaction entre la lumière et la matière dans le domaine des longueurs d’onde de 190 à 800 nm, cette méthode est au coeur de l’analyse pharmaceutique moderne.

La Pharmacopée Européenne l’utilise comme technique de référence pour l’identification et le contrôle qualité des matières premières.

Ce cours couvre :

Le fonctionnement et les types de spectrophotomètres UV-Visible

Les fondements de la loi de Beer-Lambert

Les applications : analyse qualitative, quantitative, titrage et pKa

Les techniques modernes : spectrophotométrie dérivée et analyse multicomposants

I.

Les Différents Types de Spectrophotomètres UV-Visible

Il existe deux grandes catégories de spectrophotomètres UV-Visible : les appareils à simple faisceau et les appareils à double faisceau.

Tous comportent les mêmes éléments constitutifs fondamentaux :

La source lumineuse : composée de deux lampes complémentaires

Le monochromateur : pour sélectionner la longueur d’onde d’analyse

Le compartiment à échantillon : où est placée la cuve contenant la solution

Le détecteur : photodiode ou photomultiplicateur

Types de spectrophotomètres UV-Visible et montages à simple faisceau

1.1 Les Sources Lumineuses (Lampes Polychromatiques)

Les spectrophotomètres UV-Visible utilisent deux types de lampes pour couvrir l’ensemble du spectre d’analyse :

Lampe à décharge au deutérium : domaine UV de 190 à 400 nm

Lampe à filament de tungstène : domaine visible de 350 à 800 nm

Lampe à décharge au xénon : couvre UV et visible — utilisée comme lampe flash dans les appareils modernes

Le passage automatique d’une lampe à l’autre s’effectue généralement autour de 340-360 nm selon les modèles.

1.2 Le Spectrophotomètre à Simple Faisceau

Dans un spectrophotomètre à simple faisceau, la lumière suit un trajet unique : disperseur (monochromateur) puis cellule puis détecteur.

Deux montages sont possibles :

Montage direct : le disperseur est placé avant la cellule

Montage inversé : le disperseur est placé après la cellule

Ce type d’appareil est économique et facile à utiliser, mais nécessite une mesure séparée du blanc avant chaque série de mesures.

1.3 Le Spectrophotomètre à Double Faisceau

Le double faisceau divise la lumière en deux trajets avant l’échantillon : un faisceau de référence (blanc) et un faisceau de mesure (échantillon).

Le détecteur alterne entre les deux mesures.

Avantage majeur : compensation automatique des variations de la source lumineuse, idéal pour enregistrer des spectres complets avec haute stabilité.

Figure 02 : Schéma du spectrophotomètre à double faisceau

II.

Applications de la Spectrophotométrie UV-Visible

A.

Analyse Qualitative

A.1 – Identification et Détermination de Structure

L’analyse qualitative repose sur les informations spectrales caractéristiques d’une molécule : la longueur d’onde au maximum d’absorption (lambda max), au minimum (lambda min) et le coefficient d’absorption molaire (epsilon).

Ces données peuvent compléter les informations fournies par :

La spectroscopie infrarouge (IR)

La spectrométrie de masse (SM)

La résonance magnétique nucléaire (RMN)

En pharmacie, la spectrophotométrie UV-Visible est utilisée pour l’identification de 2ème niveau des matières premières, préconisée par la Pharmacopée Européenne (Ph.

Eur.).

Pour confirmer l’identité d’une substance, le spectre UV doit répondre aux exigences suivantes :

La longueur d’onde à laquelle on obtient le maximum d’absorption

L’absorbance spécifique au maximum d’absorption

La région spectrale indiquée dans la monographie de la matière première

A.2 – Contrôle de Pureté

Le coefficient d’absorption molaire (epsilon lambda) d’un composé pur est constant dans un solvant donné.

La valeur de epsilon lambda est directement liée à la pureté du produit :

Si le composé pur est transparent et que l’impureté absorbe : l’absorbance diminue quand la pureté augmente

Si le composé lui-même absorbe : la valeur de epsilon lambda augmente avec le degré de pureté

Contrôle de pureté et loi de Beer-Lambert

B.

Analyse Quantitative : La Loi de Beer-Lambert

B.1 – La Loi de Beer-Lambert

L’analyse quantitative est basée sur la loi de Beer-Lambert, qui établit une relation linéaire entre l’absorbance d’une solution et la concentration du soluté :

A = epsilon-lambda x l x C

A : Absorbance mesurée au moyen d’un spectromètre

l (cm) : Épaisseur de la solution traversée

C : Concentration molaire de la solution examinée

epsilon-lambda : Coefficient d’absorption molaire (mol-1.L.cm-1)

Le coefficient epsilon est une constante propre au composé analysé.

Il ne varie pas avec la concentration dans le domaine de validité de la loi.

B.2 – Autres Expressions de la Loi de Beer-Lambert

La transmittance T = I/I0 (souvent exprimée en pourcentage) permet d’exprimer la loi sous d’autres formes équivalentes :

A = log(I0/I) = log(1/T) = 2 – logT%

I0 : intensité lumineuse de la radiation incidente

I : intensité lumineuse transmise

T : transmittance = I/I0

B.3 – Additivité des Absorbances

La loi de Beer-Lambert est additive : à une longueur d’onde donnée, l’absorbance d’un mélange est égale à la somme des absorbances de chaque composant :

A = A1 + A2 = L x (epsilon1 x C1 + epsilon2 x C2)

Additivité des absorbances et méthode directe de dosage

B.4 – L’Absorbance Spécifique (Ph.

Eur. 9ème Édition)

Lorsque la concentration est exprimée en g/100 mL, on utilise le coefficient d’absorption spécifique A1%1cm :

A = A1%1cm x l x C

A1%1cm = 10 x epsilon / Mr

B.5 – Méthodes Utilisées en Analyse Quantitative

a) Méthode Directe

La substance à doser est la seule qui absorbe à lambda-max.

On effectue deux mesures :

Sur la solution inconnue (concentration Cx) : epsilon x = Ax/Cx x l

Sur la solution étalon de concentration connue C : epsilon = A/c x l

En égalisant les deux équations, on obtient directement :

Cx = C x Ax / A

Ax et A sont mesurées directement par le spectrophotomètre — méthode simple et rapide.

b) Méthode Indirecte

Elle s’applique dans deux cas :

Premier cas : le composé est dans une matrice complexe, il est transformé par une réaction totale et spécifique en un dérivé absorbant

Deuxième cas : le composé n’a pas de chromophore exploitable — on fait apparaître un chromophore de remplacement par dérivation chimique

c) Dosage Simultané de Deux Composés

Un avantage majeur de la spectrophotométrie UV-Visible est la possibilité de doser simultanément deux ou plusieurs composés dans un mélange, sans séparation préalable.

Condition : chacun ne doit pas avoir d’absorption importante à la longueur d’onde du maximum de l’autre.

Figure 03 : Analyse spectrophotométrique simultanée d’un mélange à deux composés

Le système s’écrit comme 2 équations à 2 inconnues (C1 et C2) :

A-lambda1 = l x epsilon1-lambda1 x C1 + l x epsilon2-lambda1 x C2

A-lambda2 = l x epsilon1-lambda2 x C1 + l x epsilon2-lambda2 x C2

Équations du système à 2 inconnues et intérêts de la méthode

d) Intérêts de la Spectrophotométrie UV en Analyse Quantitative

Vaste champ d’application : composés organiques, inorganiques et biochimiques

Grande sensibilité : limites de détection entre 10-4 et 10-5 M

Bonne sélectivité : possibilité de choisir lambda où seul l’analyte absorbe

Bonne précision : erreur de l’ordre de 1 à 5%

Facilité de mise en oeuvre et possibilité d’automatisation

C.

Détermination des Points de Fin de Titrage

Les mesures spectrophotométriques UV-Visible permettent de déterminer les points de fin de titrage avec précision.

Appareillage :

Spectrophotomètre modifié de manière à placer le récipient du titrage dans le trajet du faisceau lumineux.

Aspects des courbes de titrage :

Les formes des courbes dépendent des coefficients d’absorption molaire des espèces en présence :

epsilon-s : coefficient d’absorption molaire de la substance à doser

epsilon-t : coefficient d’absorption molaire du réactif titrant

epsilon-p : coefficient d’absorption molaire du produit de la réaction

Figure 04 : Aspects des courbes de titrage spectrophotométrique

D.

Détermination du pKa par Spectrophotométrie UV

Principe :

Méthode basée sur la modification des absorbances en fonction du pH de deux espèces en équilibre acido-basique ayant des propriétés d’absorption différentes.

Pour un acide faible AH en équilibre avec sa base conjuguée A- :

AH <=> A- + H+

Les deux formes présentent des spectres d’absorption différents :

A pH = 2 : forme moléculaire AH -> coefficient epsilon-m

A pH = 8 : forme ionisée A- -> coefficient epsilon-i

A pH = 5,5 : équilibre et coexistence des deux formes AH et A-

Courbes d’absorption aux trois valeurs de pH et formule du pKa

Figure 07 : Aspect des courbes d’absorption à pH 2, 5,5 et 8

Protocole expérimental :

Tracer les courbes d’absorption à pH = 2, pH = 5,5 et pH = 8

Identifier lambda-opt où les différences d’absorbance sont maximales (ici lambda-opt = 358 nm)

Mesurer AT, Am et Ai à cette longueur d’onde optimale

Calcul du pKa (application de la loi d’additivité de Beer-Lambert) :

pKa = pH – log [(AT – Am) / (Ai – AT)]

AT : absorbance totale mesurée à lambda-opt (pH 5,5)

Am : absorbance de la forme moléculaire à lambda-opt

Ai : absorbance de la forme ionisée à lambda-opt

III.

Applications Avancées de la Spectrophotométrie UV

E.1 – Spectrophotométrie Dérivée : Technique Moderne

La spectrophotométrie dérivée permet d’amplifier et de préciser les particularités des courbes spectrales.

L’analyse du tracé de la dérivée comparativement au spectre initial met en évidence des différences que l’on ne pouvait observer sur les simples spectres.

Qu’est-ce qu’un spectre dérivé ?

Le spectre dérivé est la représentation graphique du quotient différentiel de l’absorbance par rapport à la longueur d’onde :

A = f(lambda) -> dA/dlambda, d2A/dlambda2, …, dnA/dlambdan

En analyse courante, on utilise les dérivées d’ordre 1, 2 et parfois 4.

La dérivée d’ordre 3 est peu ou pas utilisée.

Obtention des spectres dérivés :

La courbe dérivée est obtenue à partir d’un spectrophotomètre associé à un système de calcul électronique.

Les logiciels génèrent automatiquement les courbes dérivées à partir d’algorithmes.

Le résultat est une amélioration de la résolution spectrale permettant d’augmenter la précision des dosages.

Figure 08 : Dérivée d’ordre 0 — Courbe de Gauss et points caractéristiques

Points caractéristiques d’une courbe de Gauss :

Points A et B : points d’inflexion -> annulation de la dérivée d’ordre 2 et changement de pente

Point M (maximum) : annulation de la dérivée d’ordre 1

Dérivées successives Delta1 à Delta4 d’une courbe de Gauss

Spectres réels :

Les spectres réels sont des courbes expérimentales résultant de la superposition de plusieurs absorptions.

Les spectres dérivés sont obtenus directement à partir du spectrophotomètre.

Le signal est automatiquement transformé par l’électronique.

Figure 09 : Spectre UV de la phénylalanine et courbe de la dérivée seconde

E.2 – Analyse Multicomposants (MCA)

Lorsque l’échantillon est un mélange, il est possible de le soumettre à une analyse multicomposante sans séparation préalable des différents constituants.

La technique MCA est basée sur :

La connaissance des spectres d’absorption individuels de chaque composant

La loi d’additivité de Beer-Lambert

Le traitement mathématique par résolution de systèmes d’équations

Cette approche est particulièrement utile en pharmacie pour l’analyse de mélanges médicamenteux complexes ou de formulations galéniques multi-principes actifs.

E.3 – Utilisation comme Détecteur en Chromatographie Liquide (CLHP)

La détection spectrophotométrique basée sur la loi de Beer-Lambert est un système largement utilisé dans la chromatographie liquide à haute performance (CLHP).

Deux types d’appareils équipent les chromatographes :

Systèmes classiques : la source de lumière est monochromatique

Systèmes perfectionnés (barrette de diodes) : la source est polychromatique — mesure simultanée à plusieurs longueurs d’onde (détection multicanal)

Figure 10 : Principe du détecteur à barrette de diodes en CLHP

Principe du détecteur à barrette de diodes :

Émission d’une lumière polychromatique dans le proche UV/Visible

Dispersion de la lumière transmise par un réseau sur une barrette de photodiodes (plusieurs centaines de diodes)

Chaque diode mesure l’absorbance sur un intervalle très étroit (environ 1 nm)

Enregistrement d’un spectre UV complet pour chaque pic chromatographique

Avantage majeur : dosage simultané de plusieurs substances et vérification de la pureté des pics — essentiel en contrôle qualité pharmaceutique.

Conclusion : Points Clés à Retenir

La spectrophotométrie UV-Visible est une technique analytique polyvalente, sensible et précise qui occupe une place centrale en analyse pharmaceutique :

Deux types d’appareils : simple faisceau (économique) et double faisceau (précis et stable)

La loi de Beer-Lambert (A = epsilon x l x C) est le fondement de toute analyse quantitative

Applications qualitatives : identification et contrôle de pureté des matières premières (Ph.

Eur.)

Applications quantitatives : dosage direct, indirect et simultané de plusieurs composés

Applications spécialisées : détermination du pKa, points de fin de titrage

Utilisation en CLHP : le détecteur à barrette de diodes est l’un des détecteurs les plus puissants